Overview of Transcriptome Analysis
トランスクリプトミクスとは、mRNA を含む細胞内のすべての RNA 転写物の研究を指します。 NGS テクノロジーを使用すると、RNA-Seq を使用してすべての転写産物を正確に定量できます。 あらゆる細胞集団のトランスクリプトームを分析すると、研究対象のシステム内の遺伝子の発現について独自の洞察が得られるため、トランスクリプトーム分析は、幹細胞研究、がん研究、系統発生研究、バイオマーカー発見、さらには受精治療にも応用できる重要な技術となっています。
トランスクリプトーム分析は、特定の遺伝子の発現に関する洞察を提供するだけでなく、遺伝子が発現されたレベルについても研究者に知らせます。 さらに、トランスクリプトームデータ分析により、ゲノムレベルまたはプロテオームレベルでは特定できない可能性のある情報が得られます。 研究者は通常、トランスクリプトームに反映されるゲノムの変化や変異に興味を持ちますが、遺伝子発現の重要な変化がゲノムの変化と常に相関するとは限りません。 同様に、トランスクリプトームとプロテオームの変化の間には、通常、中程度から弱い相関関係しかありません [1]。
トランスクリプトーム解析の起源
現在までにさまざまなトランスクリプトーム解析手法が開発され、使用されています。 ヒトのトランスクリプトームを同定する最初の試みは、cDNA 配列決定技術を使用して 1991 年に行われました [2]。 その後、連結されたランダムな転写断片のサンガー配列決定を使用した遺伝子発現連続解析 (SAGE) が開発されました。 qPCR や RT-PCR などの技術もトランスクリプトーム解析に使用されました。 しかし、これらの方法は、まずマイクロアレイなどのハイスループット方法に、次に RNA-Seq に追い抜かれました。 これらの技術を比較評価すると、それぞれの有効性と限界がわかります。
| マイクロアレイ | qPCR | RNA-Seq | |
| スループット | 高い | 低い | 高い |
| RNA投入量 | 高い | 低い | 低い |
| 労働集約度 | 低い | 低い | 高い |
| 予備知識 | プローブに必要 | プローブに必要 | なし |
| 定量精度 | >90% | 利用不可 | ~90% |
| シーケンスの解決 | プローブの設計とクロスハイブリダイゼーションによる制限 | プローブの設計による制限 | シーケンス精度が最大 99% であることで制限される |
| 感度 | 10 -3 (蛍光検出による制限) | 高 (カウントはできない) | 10-6 (配列カバレッジによって制限) |
| 技術的な再現性 | >99% | >99% | >99% |
このうち、RNA-Seq は、インプットRNA量の少なさ、精度、感度などのパラメータにより、近年最も人気があります。 RNA-seq 法では、生物体または細胞サンプルから DNA を抽出し、断片化した RNA を安定な二本鎖 cDNA にコピーします。 次に、この cDNA の配列が決定され、参照ゲノムにマッピングされて、どの遺伝子が活発に転写されているかが特定されます。 このデータはさらに、新規の選択的スプライス変異体の検出、サンプルの発現シグネチャの生成、およびその他の多くの用途に使用できます。
全トランスクリプトーム解析または特定の遺伝子パネルのターゲット解析に使用できる複数の RNA-seq プラットフォームが利用可能です。 利用可能なプラットフォームには、Illumina、Ion Torrent、Pac Bio が含まれており、商用リリースの昇順にリストされています。 Illumina は、利用可能な 3 つのプラットフォームの中で最もよく使用されています [3]。
RNA-seq 実験から得られた生の配列データは、遺伝子と発現レベルに注釈を付ける前に段階的な処理を受ける必要があります。 典型的な NGS ワークフローと同様に、データ処理ステップには品質管理、アライメント、定量化、および差次的遺伝子発現が含まれます。 でご覧いただけます。 Basepair は、DESeq を使用した差次的発現から、Trinity を使用したデノボアセンブリ、deFuse を使用した遺伝子融合発見などに至るまで、トランスクリプトーム解析のための多数のパイプラインを提供します。当社の RNA-seq パイプラインの概要は、RNA-seq 解析 ページ に
ライフサイエンス研究、特にヘルスケアと疾病管理におけるトランスクリプトームデータの応用は膨大です。 以下は、トランスクリプトーム解析の必要性と必要性を強調する、影響力の大きいアプリケーションのほんの一部です。
診断と疾患プロファイリング – RNA-Seq などのトランスクリプトーム解析手法は、研究者が疾患に関連する SNP、対立遺伝子特異的発現、遺伝子融合を特定するのに役立ち、それがバリアントによって引き起こされる疾患の診断とプロファイリングに役立ちます。
宿主/病原体のトランスクリプトーム研究 – 宿主と病原体のトランスクリプトームと遺伝子発現を同時に研究するデュアル RNA-Seq メソッドの使用は、研究者が宿主と病原体の相互作用や種間の遺伝子制御ネットワークの存在を研究するのに役立ちました。
環境研究 – トランスクリプトミクスにより、研究者は遺伝子発現に対する環境要因の影響を研究し、生物的/非生物的ストレスに対する生物、特に植物の反応を測定できるようになりました。 たとえば、さまざまなヒヨコマメ系統の比較分析により、乾燥および塩分ストレスに関連する異なる転写プロファイルが特定されました [4]。
遺伝子機能のアノテーション – トランスクリプトミクスの主な貢献は、研究コミュニティがこれまで知られていなかった遺伝子の機能を特定できるようにしたことです。
トランスクリプトーム解析における新しい技術と研究におけるこの方法の広範な応用により、トランスクリプトミクスは遺伝子機能の理解をさらに進める上で重要な役割を果たし、遺伝子発現の微妙な違いを明らかにするのに役立ち、より良い医療と人類の発展を可能にします。
References
1. Stare, T., Stare, K., Weckwerth, W., Wienkoop, S., & Gruden, K. (2017). Comparison between Proteome and Transcriptome Response in Potato (Solanum tuberosum L.) Leaves Following Potato Virus Y (PVY) Infection. Proteomes.
2. Adams, M. D., Kelly, J. M., Gocayne, J. D., Dubnick, M., Polymeropoulos, M. J., Xiao, H., . . . Moreno, R. F. (1991). Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science.
3. Lowe, R., Shirley, N., Bleackley, M., Dolan, S., & Shafee, T. (2017). Transcriptomics technologies. PLoS Computational Biology.
4. Garg, R., Shankar, R., Thakkar, B., Kudapa, H., Krishnamurthy, L., Mantri, N., . . . Jain, M. (2016). Transcriptome analyses reveal genotype- and developmental stage-specific molecular responses to drought and salinity stresses in chickpea. Scientific Reports