単一細胞 RNA-seq データは、単一細胞分析パイプラインを使用して Basepair 上で迅速に分析できます。 アカウントを作成し 、fastq ファイルをアップロードして、[実行] をクリックします。 パイプラインは自動的に読み取りを調整し、バーコードを抽出し、データをクラスター化して視覚化します。

結果を解釈するときは、品質管理指標に注目することが重要です。 Basepair の単一細胞 RNA-seq レポートには、検出された遺伝子/特徴、UMI 数、ミトコンドリア比率などの細胞ごとの品質指標が含まれています。 クラスタリングおよび視覚化ツールを使用すると、クラスター全体の遺伝子の発現を視覚化できます。 単一細胞 RNA-seq データの解釈について詳しくは、 「リソース」セクションをご覧ください。

当社の単一細胞 RNA-seq パイプラインは、バーコード抽出に UMI ツール、アライメントに STAR ツール、QC に fastp、クラスタリングと視覚化に Seurat を使用します。 すべてのパイプラインは、引用度の高い、査読済みのツールを使用して構築されています。 さらに、公開されているデータセットを使用してすべてのパイプラインを検証します。 シングルセルパイプラインをどのように検証したかについて詳しくは、 こちらを ご覧ください。

Basepair には、ユーザーが治療グループと対照グループの両方に複数の複製をアップロードできる「Single cell RNA-seqintegrate」と呼ばれるパイプラインがあります。 Basepair はすべてのサンプルを個別に分析し、これらのサンプルをカウント マトリックスに組み合わせて、2 つのグループ間で発現の異なるクラスターを表示します。

Basepair は、パイプラインで使用する公開ツールの推奨デフォルト値に基づいてパラメーターを設定します。 これらのパラメーターはほとんどのデータセットで機能し、ほとんどのユーザーはこれらのパラメーターを変更する必要はありません。

主要な結果を他のデータセットまたは分析で確認することを常にお勧めします。 理想的には、さまざまな種類の技術 (分子アッセイなど) を使用します。 すべてのバイオインフォマティクス ツールにはある程度の不正確性があります。 結論を裏付ける複数の並行した結果セットがあることは、より優れた科学です。

nUMI と nGenes の関係を明示的にチェックすることはありませんが、nUMI または nGenes が高すぎる、または低すぎる遺伝子を削除するためのしきい値を提供します。 Basepair が受け取るさまざまなデータセットに対処するために、nUMI と nGenes の中央値から +/- 3 標準偏差離れたセルを個別に削除するという単純なアプローチを使用します。 ただし、これらのデフォルトのしきい値を独自のしきい値でオーバーライドできます。

遺伝子発現はまず各細胞内の総発現を考慮して正規化され、次に対数変換が適用されます。 次に、下流の教師なし解析 (PCA、t-SNE など) 用の遺伝子を選択するために、分散安定化変換 (VST) を使用して発現値の不均一分散性を補正します。 また、総 UMI 数、検出された総遺伝子、ミトコンドリアにマッピングされている読み取りの割合の細胞ごとの測定値を回帰する方法も適用します。

はい、遺伝子を検索するか、表の右側にある虫眼鏡をクリックすることができます。 これにより、遺伝子の発現レベルで各セルを色付けすることにより、t-SNE プロットが更新されます。 バイオリン プロットは、t-SNE プロットに示されているクラスターによって分割された遺伝子の発現もプロットします。

します（良い意味で）。 リードフィルタリングは、品質の低い細胞（死滅または瀕死の細胞など）や周囲の RNA に由来するリードを除去するのに役立ちます。これらはいずれも発現差に悪影響を与える可能性があります。 フィルタリングは UMI ツールを使用して実行され、最初に同じバーコードを持つ読み取りをグループ化します (各グループは理想的には 1 つのセルを表します)。

はい、「Copy data to GEO」という自動パイプラインがあり、提出のために必要なファイルを NCBI に自動的に送信します。